RT - Journal Article T1 - Cloning and expression of Iranian isolate of Apple chlorotic leaf spot virus coat protein gene in E. coli JF - gebsj YR - 2019 JO - gebsj VO - 8 IS - 1 UR - http://gebsj.ir/article-1-295-fa.html SP - 51 EP - 62 K1 - Antibody K1 - Cloning K1 - Expression K1 - Recombinant protein K1 - SDS-PAGE AB - ویروس لکه ­برگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) یکی از ویروس­های مهم درختان میوه دانه­ دار و هسته­ دار می­باشد که گسترش جهانی دارد. هدف از این مطالعه، ساخت سازه بیانی و سپس بیان ژن پروتئین پوششی (Coat Protein (CP)) ویروس لکه ­برگی کلروتیک سیب در باکتری Escherichia coli می­باشد. بیان پروتئین پوششی در سیستم پروکاریوتی، نیاز به خالص‌سازی ویروس از گیاه میزبان را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می‌سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و با آغازگرهای اختصاصیACLSV-MF وACLSV-MR ژن کامل پروتئین پوششی به طول 582 جفت باز تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه‌سازی pTG19 متصل‌ و به باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شد. باکتری‌های تراریخت شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی‌سیلین، X-Gal و IPTG غربال و به روش تجزیه قلیایی استخراج گردیدند. این ژن در پلاسمید استخراج شده با آنزیم‌های BamHI و XhoIکه محل اثر آنها در آغازگرها قرار داده شده بودند، برش و به حامل بیان pET28a(+) که با همین دو آنزیم برش داده شده بودند، اتصال داده شد. pET28a (+) حاوی ژن CP ویروس در باکتری E. coli سویه BL21(DE3) ترانسفورم و سپس القاء بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت در الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتئین حدود 26 کیلودالتونی مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس مذکور بود. بیان این پروتئین می­تواند برای تولید آنتی­ بادی بر علیه ACLSV مورد استفاده قرار گیرد. LA eng UL http://gebsj.ir/article-1-295-fa.html M3 ER -