Genetic Engineering and Biosafety Journal

fa همسانه‌سازی و انتقال آنزیم T7RNAپلیمراز باکتریوفاژ T7 به توتون Cloning and Transformation of Bacteriophage T7 RNA Polymerase in Tobacco مهندسی ژنتیک گیاهی Plant پژوهشي Research کشاورزی مولکولی به تولید پروتئینهای دارویی و آنزیمهای صنعتی توسط گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق میشود. آنزیم T7RNA پلیمراز یکی از مهمترین آنزیمهاست که به طور وسیعی در زمینههای مختلف بیوتکنولوژی و زیستشناسی سلولی و مولکولی، از قبیل سنتز و مطالعه ساختار و عملکرد RNA ها در شرایط آزمایشگاهی استفاده می شود. RNAهای سنتز شده در شرایط آزمایشگاهی در هیبریداسیون، ریزآرایه، آزمایشات   RNAiو  RNAآنتی سنس کاربرد دارد. این آنزیم همچنین در سیستمهای بیانی وابسته به پیشبر و خاتمه دهنده T7 کاربرد فراوان دارد. آنزیم T7RNA پلیمراز یک آنزیم باکتریوفاژی بوده و فعالیت اصلی آن در سیتوپلاسم میباشد. تحقیق حاضر جهت همسانه سازی، انتقال ژن آنزیم T7RNA پلیمراز به هسته سلولهای یوکاریوتی و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. آغازگرهای مناسب از روی توالی ژن T7RNA پلیمراز به همراه توالیهای مناسب برای آنزیمهای برشی، طراحی و ژن T7RNA پلیمراز مورد نظر پس از جداسازی در ناقل بیانیpCAMBIA1304 همسانهسازی شد. به منظور اطمینان از همسانهسازی، سازه تهیه شده با استفاده از PCR، هضم آنزیمی و توالییابی بررسی شده و همردیفی آن در بانک اطلاعاتی اسیدهای نوکلئیک تأیید گردید. سپس، سازه نوترکیب به کمک سویه LB4404 آگروباکتریوم به گیاهان توتون منتقل و گیاهان تراریخته بر روی محیطهای کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیکهای هیگرومایسین و سفوتاکسیم، باززا شدند. حضور و بیان ژن T7RNA پلیمراز در گیاهان تراریخته با روشهای PCR وRT- PCR  تأیید شد. <table align="left" cellpadding="0" cellspacing="0" height="67" hspace="0" style="mso-element-frame-height:50.2pt;mso-element-frame-height:50.2pt;" vspace="0"> <tbody> <tr> <td align="left" height="67"></td> </tr> </tbody> </table> <div style="clear:both;"></div> Molecular farming refers to the production of pharmaceutical proteins and industrial enzymes in plants by genetic engineering. T7RNA Polymerase is one of the most important enzymes which is used in various fields of biotechnology and molecular biology to produce RNA and study the structure and function of RNA in vitro. The in vitro synthesized RNA is employed in hybridization, microarray, anti-sense RNA and RNAi experiments. This enzyme has also applications in expression systems depending on the T7 promoter and terminator. T7RNA polymerase is a bacteriophage enzyme which acts mainly in the cytoplasm. This study aimed to clone and transform eukaryotic cells with the T7RNA Polymerase gene for production of T7 polymerase in tobacco plants. Specific primers with proper restriction enzyme sites were designed corresponding to the ends of the T7RNA polymerase gene and the gene was isolated and cloned into the plant expression vector, pCAMBIA1304.  Successful of gene insertion was confirmed by PCR, restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The recombinant construct was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain for tobacco transformation. The transgenic tobacco plants were regenerated on selective media containing hygromycin and cefotaxime antibiotics.  The presence and expression of the T7RNA polymerase gene in the transgenic plants was confirmed by PCR and RT-PCR techniques. آنزیم T7RNA پلیمراز, همسانه سازی, انتقال ژن, توتون, کشاورزی مولکولی T7 RNApolymerase enzyme, Cloning, Gene transfer, Tobacco, Molecular farming 67 75 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-197-1&slc_lang=fa&sid=1 Kobra Nalbandi کبری نعلبندی nalbandi643@yahoo.com 10031947532846001466 10031947532846001466 No دانشگاه بوعلی سینا همدان دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی Asghar Mirzaie Asl اصغر میرزایی اصل a.mirzaie@basu.ac.ir 10031947532846001467 10031947532846001467 Yes Department of Biotechnology, College of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamadan, Iran دانشگاه بوعلی سینا همدان دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی Leila Khodaei لیلا خدایی mirzaei.asl@gmail.com 10031947532846001468 10031947532846001468 No دانشگاه پیام نور همدان، دانشکده کشاورزی Gholam Khodakaramian غلام خداکرمیان khodakaramian@yahoo.com 10031947532846001469 10031947532846001469 No دانشگاه بوعلی سینا همدان،دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی کشاورزی