Genetic Engineering and Biosafety Journal

fa طراحی و ساخت وکتور نوترکیب merB به منظور پاکسازی زیستی جیوه آلی Construction of merB recombinant vector in order to bioremediation of organic mercury ایمنی زیستی Biosafety پژوهشي Research متیل جیوه یکی از فرم های پایدار جیوه آلی است که می تواند وارد زنجیره غذایی موجودات زنده گردد و خطرات زیست محیطی جبران ناپذیری را برای اکوسیستم طبیعی بوجود آورد. پایداری جیوه و هزینه زیاد روش های مرسوم پالایش عوامل نگران کننده ای هستند. در این رابطه، روش های بیولوژیکی مانند استفاده از بیوراکتورهای مبتنی بر باکتری ها یا آنزیم های آنها بعنوان یکی از روش های میکروب پالایی راه حلی پایدار، کم هزینه و دوست دار محیط زیست ارایه می دهد. در این پژوهش ژن merB از باکتری Serratia marcescens مناطق آلوده به جیوه جداسازی شده و سپس جهت کلونینگ در وکتور بیانی، با آنزیم های NcoI / NdeIبرش داده شد و پس از خالص سازی، به وکتور بیانی   pET28a(+) الحاق صورت گرفت. وکتور نوترکیب pET28(a+)-merB به باکتری E.coli  سویه TOP10 منتقل و در آن تکثیر شد. سپس روی کلنی های رشد یافته درمحیط گزینشی کانامایسین واکنش زنجیره ای پلیمراز روی کلنی ها صورت گرفت. واکنش زنجیره ای پلیمراز روی پلاسمید با آغازگرهای اختصاصی ژن انجام و پس از تایید با هضم آنزیمی پلاسمید برای تعیین توالی ارسال شد. نتایج به دست آمده صحت همسانه سازی ژن merB را در وکتور بیانی نشان داد. این وکتور نوترکیب به منظور بیان پروتئین مورد نظر به باکتری E. coli سویه BL21(DE3) منتقل و بیان پروتئین مورد نظر با کاربرد روش SDS-PAGE تایید شد. در نهایت عملکرد پروتئین MerB در محیط حاوی جیوه بررسی و نتایج بیانگر افزایش مقاومت به جیوه در باکتری های نوترکیب به دست آمده بود. به کمک این سیستم و با تولید آنزیم MerB میتوان از طریق روش های مختلف زیست پالایی اقدام به پاکسازی جیوه از مناطق آلوده نمود. Organic mercury is a sustainable form of mercury that enters the food chain of organisms and cause dangerous environmental hazards for natural ecosystem. Mercury stability and high cost conventional refining methods are disturbing factors. In this field, biological methods such as the use of bacteria or enzyme based for microbial remediation provided low-cost strategy and environmental lover of bioremediation. In this research, merB gene isolated from resistance bacteria by PCR technique by specific primers containing NcoI and NdeI restriction sites, so after amplification, it cut with restriction enzymes and after purification of gene, ligation was performed into PET28 a+ expression vector. PET28a+-merB recombinant vector was transferred into E. coli strain TOP10 by heat shock. The recombinant bacteria were selected in kanamycin selective medium. The presence of gene in transformed bacteria was confirmed by PCR on plasmid and by enzymatic digestion. Results confirmed the accuracy of cloning of merB gene into this expression vector. In order to the expresse its protein, the recombinant vector was transferred into E. coli BL21 (DE3). Expression of the protein was confirmed by SDS-PAGE method. Finally, the growth of E.coli strain BL21 containing the recombinant vector with E coli BL21 bacteria including empty vector was measured by adding methyl mercury into the environment during 48 hours. Growth ability of E.coli containing the empty vector indicates lack of bacteria resistance to mercury, on the other hand; merB protein in transformed bacteria increased their resistance to methyl mercury in the environment. Therefore, bioremediation of organic mercury from pollutant environments could be possible by using this methodology.   جیوه, ژن کاهنده جیوه آلی, وکتور نوترکیب Organic mercury, reducing gene of organic mercury, recombinant vector 309 319 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-49-2&slc_lang=fa&sid=1 Alireza Tarinejad علیرضا تاری نژاد atarinejad@yahoo.com 10031947532846002023 10031947532846002023 Yes Department of Agricultural Biotechnology, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran. گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی،دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران Hamideh Baghi حمیده باغی hamideh.baghi@gmail.com 10031947532846002024 10031947532846002024 No Department of Agricultural Biotechnology, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran. گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی،دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران Maryam Farshbaf Benam مریم فرشباف بنام maryam_farshbaf@ymail.com 10031947532846002025 10031947532846002025 No Department of Agricultural Biotechnology, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran. گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی،دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران Mohammad Pazhang محمد پاژنگ mpazhang@yahoo.com 10031947532846002026 10031947532846002026 No Cellular and molecular biology Dept., Basic science Faculty, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران