Genetic Engineering and Biosafety Journal

fa همسانه سازی و بیان ژن پروتئین پوششی جدایه‌ ایرانی ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (ACLSV) در E. coli Cloning and expression of Iranian isolate of Apple chlorotic leaf spot virus coat protein gene in E. coli مهندسی ژنتیک میکروارگانیسم ها و ویروسها Microrganisms and Viruses پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) یکی از ویروسهای مهم درختان میوه دانه دار و هسته دار میباشد که گسترش جهانی دارد. هدف از این مطالعه، ساخت سازه بیانی و سپس بیان ژن پروتئین پوششی (Coat Protein (CP)) ویروس لکه برگی کلروتیک سیب در باکتری Escherichia coli میباشد. بیان پروتئین پوششی در سیستم پروکاریوتی، نیاز به خالص‌سازی ویروس از گیاه میزبان را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می‌سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و با آغازگرهای اختصاصیACLSV-MF وACLSV-MR ژن کامل پروتئین پوششی به طول 582 جفت باز تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه‌سازی pTG19 متصل‌ و به باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شد. باکتری‌های تراریخت شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی‌سیلین، X-Gal و IPTG غربال و به روش تجزیه قلیایی استخراج گردیدند. این ژن در پلاسمید استخراج شده با آنزیم‌های BamHI و  XhoIکه محل اثر آنها در آغازگرها قرار داده شده بودند، برش و به حامل بیان pET28a(+) که با همین دو آنزیم برش داده شده بودند، اتصال داده شد. pET28a (+) حاوی ژن CP ویروس در باکتری E. coli سویه BL21(DE3) ترانسفورم و سپس القاء بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت در الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتئین حدود 26 کیلودالتونی مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس مذکور بود. بیان این پروتئین میتواند برای تولید آنتی بادی بر علیه ACLSV مورد استفاده قرار گیرد.  </div> <div style="text-align: justify;">The Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) is among of the most common virus infecting pome and stone fruit trees around the world. The virus has spread throughout the world and has been reported in many hosts such as; apples, pears, peaches and cherries. The purpose of this study is to express the coat protein (CP) of ACLSV in E. coli. CP expression in E. coli has been developed to prepare antigen for antibody production without needs to purify the virus from infected plant. In this study, complete CP gene (582 bp) from an isolate of ACLSV (SSa) was amplified by specific primers, MF and MR. The amplified CP gene was ligated to TA cloning vector (pTG19-ACLSV CP) and transformed into E. coli strain DH5α. Transformed cells were selected on LB containing ampicillin, X-Gal and IPTG, and recombinant plasmids were confirmed by restriction analysis. Then, the pTG-ACLSV CP was sub-cloned into pET28a (+) as expression vector that digested by BamHl and XhoI restriction enzymes. Finally, the pET28a-ACLSV CP was transformed into E. coli strain BL21 by heat shock method. For ACLSV CP expression, the cells containing pET28a-ACLSV CP were induced by 1 mM of IPTG and the protein was extracted two and four hours after induction and analyzed in SDS-PAGE. The SDS-PAGE result showed that ACLSV CP have been expressed that is expected based on additional tags from plasmid. </div> <div style="text-align: justify;"></div> آنتی‌بادی, الکتروفورز عمودی, بیان, پروتئین نوترکیب, همسانه‌سازی Antibody, Cloning, Expression, Recombinant protein, SDS-PAGE 51 62 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-323-1&slc_lang=fa&sid=1 Danyal Mirzaei دانیال میرزایی mirzaeidanyal@gmail.com 10031947532846003117 10031947532846003117 No Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران Mohammad Hajizadeh محمد حاجی زاده m.hajizadeh@uok.ac.ir 10031947532846003118 10031947532846003118 Yes Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران Abdolbaset Azizi عبدالباسط عزیزی abdolbasetazizi@gmail.com 10031947532846003119 10031947532846003119 No Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران Davoud Kolivand داود کولیوند d.koolivand@gmail.com 10031947532846003120 10031947532846003120 No Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران