fa همسانه سازی و بیان هترولوگ لاکاز در Pichia pastoris و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی لاکاز نوترکیب مهندسی ژنتیک میکروارگانیسم ها و ویروسها Microrganisms and Viruses پژوهشي Research <strong><span style="font-family:b zar;">لاکازها آنزیم&shy;هایی حاوی مس می&shy;باشند که اکسیداسیون ترکیبات آروماتیک و غیرآروماتیک را از طریق احیای مولکول اکسیژن به آب کاتالیز می&shy;کنند</span></strong> <strong><span style="font-family:b zar;">. همچنین به دلیل قابلیت اکسیداسیون طیف وسیعی از ترکیبات فنلی کاربرد وسیعی در صنعت دارند. در این مطالعه توالی نوکلئوتیدی ژن لاکاز بر اساس ترجیح کدونی میزبان مخمری </span></strong><strong><em><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">Pichia pastoris</span></span></em></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"> GS115</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> بهینه شد، سپس توسط شرکت اینویتروژن سنتز و در حامل بیانی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">pPICZ alpha A</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> همسانه سازی شد و تحت پیشبر </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">AOX1</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> به مخمر پیکیا پاستوریس به روش الکتروپوریشن منتقل شد. به منظور تعیین شرایط بهینه بیش بیان آنزیم، در سطوح مختلفی از دما، غلظت مس و متانول القای بیان صورت گرفت و فعالیت آنزیم در هریک از سطوح ارزیابی شد. بیش بیان آنزیم در غلظت 4/0 میلی&shy; مولار مس و 8/0 درصد متانول و دمای 25 درجه سانتی&shy;گراد به دست &shy;آمد. بیش&nbsp; بیان ترشحی لاکاز در شرایط بهینه </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">&nbsp;U/L</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> 9600 به دست&shy;آمد. پس از بررسی کیفی و کمی آنزیم برخی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم تعیین شد. دما و </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">pH</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> بهینه لاکاز نوترکیب به ترتیب40 درجه سانتی&shy;گراد و 3 تعیین شد. بررسی پایداری دمایی و </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">pH</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> لاکاز نشان داد که این آنزیم پایداری بالایی در برابر حرارت داشته و قادر به فعالیت در طیف وسیعی از </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">pH</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> می&shy;باشد. بررسی خصوصیات کینتیکی آنزیم با استفاده از سوبسترای </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">ABTS</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;">، </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">mM</span></span></strong> <strong><span style="font-family:b zar;">۰۸۹<em>/۰ </em></span></strong><strong><em><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">Km</span></span></em></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">=</span></span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> تعیین شد. نتایج این تحقیق نشان داد که مخمر پیکیا پاستوریس می&shy;تواند کاندیدای مناسبی برای بیان لاکاز نوترکیب به منظور استفاده در صنایع متعدد جهت پاکسازی پساب، بیوسنسور و سایر کاربردها باشد.</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:red;"><span style="font-family:times new roman,serif;"></span></span></span></strong><br> <span dir="LTR"></span> Laccase (EC 1.10.3.2) enzymes are multi-copper oxidase which catalyze the oxidation of aromatic and non- aromatic compounds with electron reduction of molecular oxygen to water. These enzymes catalyze the oxidation of a wide array of phenolic compound and have been used in different industrial field. In this study, Nucleotide sequence of laccase (accession number: AY081188.1) was optimized according to the codon preference of <em>Pichia pastoris</em>. Laccase gene was synthesized and cloned into pPICZalpha A. under control of AOX1 promoter then transformed to <em>P. pastoris</em> by electroporation. Methanol concentration, copper salts concentration and temperature were varied in order to enhance laccase expression in the heterologous system. Optimal fermentation condition for laccase production in shake flask cultivation using BMGY medium were obtained by presence of 0.4 mM Cu⁺², at 25&deg;C culture temperature, by 0.8% methanol added into culture every 24 h. the volumetric activity was achieved 9600 U/L after 12-day culture in fernbach flask. The biochemical properties of recombinant laccase and kinetic parameters were studied. The laccase activity was optimal at pH 3 and 40&deg;C. Its <em>K_m</em> value was 0.089 mM for ABTS [2, 2&acute;azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphoric acid)]. The result of this study was showed that <em>Pichia pastoris</em> can be useful tool for heterologous laccase expression in order to use in industrial application such as wastewater treatment, biosensor & etc. لاکاز, پیکیا پاستوریس, بیان هترولوگ, زیست‌پالایی, همسانه سازی laccase, Pichia pastoris, heterologous expression, bioremediation, cloning 121 131 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-318-2&slc_lang=fa&sid=1 Elham Soleimani الهام سلیمانی solimanielham@yahoo.com 10031947532846003067 10031947532846003067 No Genetic & Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan(GABIT). Sari Agricultural Sciences & Natural Resources University (SANRU) پژوهشکده ژنتیک و زیست‌فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری GhorbanAli Nematzadeh قربانعلی نعمت زاده Gh.nematzadeh@gmail.com 10031947532846003068 10031947532846003068 Yes Genetic & Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan(GABIT). Sari Agricultural Sciences & Natural Resources University (SANRU), Sari, Iran پژوهشکده ژنتیک و زیست‌فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری Rouha Kasra kermanshahi روحا کسری کرمانشاهی rkasra@yahoo.com 10031947532846003069 10031947532846003069 No Alzahra university, Tehran . Iran دانشگاه الزهرا (س) Susana Rodriguez-Couto سوسانا رودریگز کوتو Susanarodriguezcouto@gmail.com 10031947532846003070 10031947532846003070 No Ikerbasque, Basque Foundation for Science سازمان ایکرباسک اسپانیا