fa ایجاد سیستم شناسایی وجود کوفاکتور مولیبدئوم در باکتری Escherichia coli مهندسی ژنتیک گیاهی Plant پژوهشي Research <div style="text-align: justify;"><strong><span style="font-family:B Zar;">یکی از آنزیم&shy;های درگیر در تطبیق پذیری با شرایط مختلف محیطی، آنزیم بیوتین سولفوکساید ریداکتاز (BisC) است که علاوه بر توانایی تبدیل بیوتین سولفوکساید به بیوتین در شرایط اکسیداتیو، می&shy;تواند متیونین سولفوکساید را نیز به متیونین تبدیل کند. اسید آمینه متیونین چه بصورت آزاد و چه در زنجیره پروتئینی اهمیت بسیاری در فرایند سنتز پروتئین و فعالیت آن داراست. آنزیم بیوتین سولفوکساید ریداکتاز (BisC) برای فعال بودن وابسته به کوفاکتور باکتریایی MGDـBis می&shy;باشد. در این مطالعه به منظور تایید فعال بودن کوفاکتور باکتریایی MGDـBis روشی غیرمستقیم طراحی شد که در این روش از آنزیم باکتریایی بیوتین سولفوکساید (BisC) به عنوان ژن گزارشگر استفاده شد</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">.</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> در این راستا سازه ژنی BisCـpJet &rlm;ساخته شد و شوک حرارتی به باکتری <em>E.coli</em> استرین Mach1 منتقل شد. کلون&shy;های تشکیل شده در محیط LB</span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> جامد با آنتی بیوتیک آمپیسیلین </span></strong>&nbsp;<strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">200 &micro;g/ml</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> انتخاب شدند و سپس واکنش </span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">PCR</span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> روی آنها صورت گرفت.</span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> پس از تایید نتایج توالی یابی کلون&shy;های مثبت، قطعه مورد نظر جدا و به ناقل بیانی pETDuet انتقال داده &shy;شد. </span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">کلون</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:B Zar;">&lrm;</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">های حاوی ژن به باکتری میزبان </span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">Rossetta </span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">منتقل شدند.</span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> &nbsp;فرابیان آنزیم BisC بر روی ژل PAGEـSDS مورد بررسی قرار گرفت و نیز فعالیت این آنزیم بصورت باند بی</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:B Zar;">&lrm;</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">رنگ بر اثر اکسید شدن متیل وایولوژن روی ژل&nbsp; Native مشاهده شد که نشان دهنده حضور فعال کوفاکتور MGDـBis بود.</span></strong> <strong><span dir="LTR"><span style="color:red;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"></span></span></span></strong></div> <strong><span dir="LTR"><span style="color:red;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"></span></span></span></strong> <div style="text-align: justify;">Biotin sulfoxide reductase enzyme is one of the enzymes involved in adaptation to different environmental conditions. BisC enzyme converts biotin sulfoxide to biotin and Methionine sulfoxide to Methionine under oxidative stress conditions. Both free Methionine and protein bound chains Methionine are essential in protein synthesis process and the function of proteins. The activity of the BisC enzyme is dependent to the Bis-MGD as a co-factor. In the current study, in order to verify the presence of bacterial Molybdeum cofactor, an indirect approach was made by showing the activity of BisC enzyme as a reporter gene. Therefore, in this regard <em>BisC</em> gene was cloned to pJet vector and was transferred to Mach1 strain of <em>E. coli</em> by heat shock transformation. The clones were selected on LB medium complemented with 200 &micro;g/ml of Ampicillin antibiotic and the PCR reaction was done. After verifying of positive clones by sequencing, the <em>BisC</em> gene was digested and ligated to the pETDuet expression vector and transferred to Rossetta. Over-expression of BisC enzyme was analyzed on a SDS-PAGE gel and the activity of the enzyme could be showed as a colorless band on the Native gel by oxidation of methyl viologen. It proved the presence of active Bis-MGD as a cofactor.</div> اشریشیا کلای, بیان بیش از حد, بیس ـ ام جی دی, بیوتین سولفوکساید, مولیبدئوم Key words: Bis-MGD, Biotin sulfoxide, Escherichia coli, Molybdenum, Over expression 11 18 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-365-1&slc_lang=fa&sid=1 Kiana Kabir کیانا کبیر Kiana_Kabir@yahoo.com, Kiana_Kabir@yahoo.com 10031947532846003475 10031947532846003475 No Department of Plant Breeding and Biotechnology, College of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Science and Natural Resources, Iran گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، ایران Khalil Zaynali Nezhad خلیل زینلی نژاد Khalil1381@yahoo.com 10031947532846003476 10031947532846003476 Yes Department of Plant Breeding and Biotechnology, College of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Science and Natural Resources, Iran گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، ایران Andreas Weber آندریاس وبر andreas.weber@uni-duesseldorf.de 10031947532846003477 10031947532846003477 No Plant Biochemistry Group, Heinrich Heine University, Dusseldorf, Germany گروه بیوشیمی گیاهی، دانشگاه هاینریش هاینه، دوسلدورف، آلمان Seyede Sanaz Ramezanpour سیده ساناز رمضانپور Ramezanpours@gau.ac.ir 10031947532846003478 10031947532846003478 No Department of Plant Breeding and Biotechnology, College of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Science and Natural Resources, Iran گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، ایران Marion Eisenhut ماریون آیسنهوت m.eisenhut@uni-duesseldorf.de 10031947532846003479 10031947532846003479 No Plant Biochemistry Group, Heinrich Heine University, Dusseldorf, Germany گروه بیوشیمی گیاهی، دانشگاه هاینریش هاینه، دوسلدورف، آلمان