Genetic Engineering and Biosafety Journal

fa تهیه آنتی‌بادی چند همسانه‌ای نوترکیب علیه ویروس لکه‌برگی کلروتیک سیب و بررسی کارایی آن Preparation of recombinant polyclonal antibody against Apple chlorotic leaf spot virus and its efficiency مهندسی ژنتیک میکروارگانیسم ها و ویروسها Microrganisms and Viruses پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">یکی از ویروسهای مهم آلوده‌کننده درختان میوه، ویروس لکه‌برگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV است. تهیه آنتی بادی و طراحی کیت الایزا و بیوسنسورها یکی از راهبردهای مفید در تشخیص زود هنگام عوامل بیماری&lrm;‌زا در نمونه های با تعداد زیاد است. در همین راستا، تحقیق حاضر با هدف تولید آنتی‌بادی چندهمسانه ای نوترکیب و طراحی کیت الایزا جهت ردیابی سریع ویروس لکه برگی کلروتیک سیب با استفاده از بیان در سیستم پروکاریوتی انجام شد. ابتدا، سازه pTG19-ACLSV-CP به باکتریEscherichia coli  سویه DH5α منتقل و پس از تکثیر و استخراج پلاسمید نوترکیب، ژن پروتئین پوششی با استفاده از آنزیمهای برشی خارج و درون پلاسمید بیان pET28(a) همسانه‌سازی گردید. سازه بیان pET28-ACLSV-CP ساخته شده به‌منظور بیان پروتئین، به باکتری E. coli  سویه BL21(DE3) منتقل شد. پس از بهینه‌سازی، بیان و استخراج پروتئین پوششی، نوار پروتئینی با اندازه تقریبی 27 کیلودالتون چهار ساعت بعد از القاء مشاهده شد. سپس، پروتئین بیان شده به روش طبیعی با ستون Ni-NTA Agarose، خالص‌سازی شد. پروتئین خالص شده، به‌عنوان آنتی‌ژن به خرگوش ماده نژاد نیوزیلندی طی چهار مرحله تزریق شد. ایمنوگلوبولینها با استفاده از کیت تخلیص IgG مبتنی بر پروتئین A از سرم خون به دست آمده از خرگوشهای ایمن شده تخلیص شدند. کارایی ایمنوگلوبولین‌های خالص شده، نشان داد که کاربرد غلظت 1:1000 آنتی‌بادی نوترکیب تهیه شده و نشاندار برای ردیابی آنتی‌ژن‌های موردنظر مناسب هستند. نتایج آزمونهای مختلف نشان داد، آنتی‌بادی تولید شده جهت ردیابی ویروس لکه برگی کلروتیک سیب دارای اختصاصیت و کارایی مناسب است،  و از این آنتی بادیها میتوان برای شناسایی این ویروس به منظور غربال درختان و یا نمونههای مشکوک استفاده کرد.</div> <div style="text-align: justify;">Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) is one of the most important viruses infecting fruit trees. Preparation antibodies, ELISA kit and, biosensors are one of the applicable strategies to rapid and efficient screen a number of viral samples. To aim, the recent study was conducted to raise recombinant polyclonal antibodies to rapid detection of Apple chlorotic leaf spot virus by expressing coat protein gene in the prokaryotic system. First, the pTG19-ACLSV-CP was transformed to E. coli DH5α, the replicated plasmids were extracted and double digested was optimized by restriction enzymes, then the released fragment (Coat protein gene) was cloned into pET28 as an expression vector. Next, the expression construct (pET28a-ACLSV-CP) was transformed into E. coli strain BL21 (DE3) to express the coat protein gene. After optimization of expression the transformed cells, a protein band an approximate size of 27 kDa (22 kDa for coat protein and about 5 kDa for histidine tags) was observed at four hours after induction. The recombinant protein was purified by native methods using Ni-NTA Agarose column, then purified proteins were injected into New Zealand female rabbits in four steps as antigen. IgGs were purified from serums raised from immunized rabbits using an IgG purification kit. The efficiency of purified IgGs was approved that a 1: 1000 concentration of recombinant anti-ACLSV-CP antibodies are efficient to detect the desired antigens. The results showed the raised antibodies have enough specificity to detect Apple chlorotic leaf spot virus in gardens and seedlings. </div> لکه‌برگی کلروتیک سیب, پلاسمید, بیان پروتئین, ژن پروتئین پوششی, خالص سازی ACLSV, Plasmid, Protein Expression, Coat Protein Gene, Purification 68 80 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-286-2&slc_lang=fa&sid=1 Maryam Afrashtehg مریم افراشته m.afrashteh1993@gmail.com 10031947532846005222 0009-0009-5035-2519 No Professor Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture University of Zanjan, Zanjan, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران Davoud Koolivand داود کولیوند Koolivand@znu.sc.ir 10031947532846005223 10031947532846005223 Yes Professor Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture University of Zanjan, Zanjan, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران Mohammad Hajizadeh محمد حاجی زاده hajizadeh2003@gmail.com 10031947532846005224 10031947532846005224 No Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران Nahid Masoudi ناهید مسعودی nm_masoudi@yahoo.com 10031947532846005225 10031947532846005225 No Department of Plant Protection, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران