Genetic Engineering and Biosafety Journal

fa طراحی و ساخت ناقل نوترکیب pTargetF حمل کننده ی gRNA اختصاصی ژن entB برای سامانه CRISPR/Cas9 در E.coli سروگروه O2 مهندسی ژنتیک میکروارگانیسم ها و ویروسها Microrganisms and Viruses پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">کلی‌باسیلوز ناشی از Escherichia coli سروگروه O2 یکی از بیماری‌های مهم باکتریایی در صنعت طیور است که می‌تواند خسارات اقتصادی قابل توجهی ایجاد کند. افزایش مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های بیماری‌زا، ضرورت استفاده از راهکارهای جایگزین از جمله طراحی واکسن‌ها و سویه‌های تخفیف حدت‌یافته را برجسته کرده است. هدف از این مطالعه، طراحی و ساخت ناقل نوترکیب CRISPR/Cas9 حامل gRNA اختصاصی ژن entB در E. coli سروگروه O2 به‌عنوان گامی اولیه در مسیر طراحی سویه تخفیف حدت‌یافته بود. در این مطالعه، gRNA اختصاصی علیه ژن entB با استفاده از پایگاه CHOPCHOP طراحی شد. الیگونوکلئوتیدهای رفت و برگشت مربوط به gRNA سنتز شده و پس از آنیلینگ (annealing)، درون پلاسمید pTargetF خطی‌شده با آنزیم BbsI، با استفاده از T4 DNA Ligase جایگذاری شدند. ناقل نوترکیب حاصل به سلول‌های مستعد DH5α منتقل شد و ورود قطعه gRNA به داخل وکتور با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و همچنین تعیین توالی تأیید گردید. نتایج نشان داد که توالی راهنمای طراحی‌شده با موفقیت در وکتور pTargetF کلون شده است. مشاهده باندهای مورد انتظار در آزمون PCR، صحت ساخت سازه نوترکیب را تأیید کرد. بر اساس یافته‌های این پژوهش، ناقل نوترکیب طراحی‌شده می‌تواند به‌عنوان ابزاری مقدماتی برای هدف‌گیری ژن entB و مطالعات بعدی در زمینه تخفیف حدت سویه‌های بیماری‌زای E. coli طیور مورد استفاده قرار گیرد.  </div> <div style="text-align: justify;">Colibacillosis caused by Escherichia coli serotype O2 is one of the major bacterial diseases in the poultry industry, leading to substantial economic losses. The increasing prevalence of antibiotic resistance among pathogenic strains has highlighted the necessity for alternative strategies, including the development of vaccines and attenuated strains. The aim of this study was to design and construct a recombinant CRISPR/Cas9 vector carrying a specific gRNA targeting the entB gene in E. coli serotype O2, as an initial step toward the development of an attenuated strain. In this study, a specific gRNA against the entB gene was designed using the CHOPCHOP web tool. The forward and reverse oligonucleotides corresponding to the gRNA were synthesized and, following annealing, were ligated into the BbsI-linearized pTargetF plasmid using T4 DNA ligase. The resulting recombinant vector was then transformed into competent DH5α cells. The successful insertion of the gRNA fragment into the vector was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and subsequent sequencing. The results demonstrated that the designed guide sequence was successfully cloned into the pTargetF vector. The observation of the expected bands in PCR analysis confirmed the correct construction of the recombinant construct. Based on the findings of this study, the designed recombinant vector can serve as a preliminary tool for targeting the entB gene and for future investigations aimed at attenuating pathogenic E. coli strains in poultry.</div> اشریشیا کلی, سروگروه O2, CRISPR/Cas9, entB, gRNA, ناقل نوترکیب, کلی‌باسیلوز Escherichia coli, serogroup O2, CRISPR/Cas9, entB, gRNA, recombinant vector, colibacillosis 0 0 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-563-2&slc_lang=fa&sid=1 Mohadese Amiri محدثه امیری mohadeseamiri1990@gmail.com 10031947532846006261 10031947532846006261 No Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran. گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران Mehdi Golchin مهدی گلچین golchin@uk.ac.ir 10031947532846006262 10031947532846006262 Yes Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran. گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران. Abbas Hajizade عباس حاجی زاده abbashajizade@gmail.com 10031947532846006263 10031947532846006263 No Biology Research Center, Faculty of Basic Sciences, Imam Hossein University, Tehran, Iran مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه امام حسین، تهران، ایران. Hamidreza Farzin حمیدرضا فرزین hrfarzin@yahoo.com 10031947532846006264 10031947532846006264 No Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Mashhad, Iran. موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی ،مشهد، ایران. Majid Jamshidian Mojaver مجید جمشیدیان مجاور m.jamshidian@rvsri.ac.ir 10031947532846006265 10031947532846006265 No Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Mashhad, Iran. موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی ،مشهد، ایران.