fa همسانه سازی و بیان ژن سلوبیوهیدرولاز cel6B در مخمر Pichia pastoris مهندسی ژنتیک میکروارگانیسم ها و ویروسها Microrganisms and Viruses پژوهشي Research <strong><span style="font-family:b zar;">آنزیم </span></strong><strong><span dir="LTR">Cel6B</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> از باکتری </span></strong><strong><em><span dir="LTR">Thermobifidia fusca</span></em></strong><strong><span style="font-family:b zar;">، یک </span></strong><strong><span dir="LTR">CBHII</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> متعلق به خانواده بی سلولازهاست که بسیار مقاوم به حرارت است. به علت میزان پایین تولید این آنزیم در میزبان اولیه نمی‌توان از این میزبان برای تولید آنزیم در مقیاس صنعتی استفاده نمود. به منظور بیان این آنزیم در مخمر، ژن سلوبیوهیدرولاز موجود در سازه </span></strong><strong><span dir="LTR">PSZ143</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> با </span></strong><strong><span dir="LTR">PCR</span></strong> <strong><span style="font-family:b zar;">تکثیر و به درون ناقل مخمری </span></strong><strong><span dir="LTR">pPICZ&alpha;A</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;">، همسانه‌سازی شد. سازه نوترکیب حاوی ژن </span></strong><strong><em><span dir="LTR">cel6B</span></em></strong><strong><em><span style="font-family:b zar;">،</span></em></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> به باکتری </span></strong><strong><span dir="LTR">Jm109</span></strong> <strong><em><span dir="LTR">E. coli</span></em></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> منتقل شده و باکتری‌های نوترکیب بر روی محیط کشت </span></strong><strong><span dir="LTR">LB</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> حاوی </span></strong><strong><span dir="LTR">&nbsp;&micro;g/ml</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;">5/0 بلئومایسین، انتخاب شد. سازه نوترکیب خطی شده، با استفاده از الکتروپوریشن به مخمر</span></strong><strong><em><span dir="LTR">Pichia pastoris</span></em></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> سویه‌های </span></strong><strong><span dir="LTR">GS115</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> و </span></strong><strong><span dir="LTR">KM71H</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> منتقل شد. در نهایت بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم نیز با روش </span></strong><strong><span dir="LTR">DNS</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> تعیین شد. نتایج نشان داد، بیشترین میزان فعالیت سلوبیوهیدرولاز در سویه‌های </span></strong><strong><span dir="LTR">GS115</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> و </span></strong><strong><span dir="LTR">KM71H</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> و بر روی </span></strong><strong><span dir="LTR">PC</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> (پنبه اسید فسفریک شده) در دمای </span></strong><strong><span dir="LTR">C</span></strong><strong><span style="font-family:cambria,serif;">&deg;</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;">50 و به مدت 16 ساعت، به ترتیب 98/1 و </span></strong><strong><span dir="LTR">U(</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:symbol;">m</span></span></strong><strong><span dir="LTR">mol/min)/ml</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> 475/0 است. نمونه مربوط به کلنی پر محصول سویه </span></strong><strong><span dir="LTR">GS115</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> بر روی ژل </span></strong><strong><span dir="LTR">SDS-PAGE</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;"> بارگزاری و بیان آنزیم تأیید شد و سپس نتایج بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم با همین سویه، در روز چهارم بعد از القاء با 3 درصد متانول (</span></strong><strong><span dir="LTR">V/V</span></strong><strong><span style="font-family:b zar;">) به‌دست آمد. عدم بهینه‌سازی کدون های ژن همسانه شده به پلاسمید مخمری باعث کاهش بیان و کاهش فعالیت سلوبیوهیدرولازی آن شد. مخمر پیشیا میزبان مناسبی برای بیان این آنزیم است که با بهینه‌سازی کدونهای توالی کدکننده این ژن، می‌توان بازدهی بیان را بهبود داد.</span></strong><br> <span dir="LTR"></span> The Cel6B enzyme from <em>Thermobifidia fusca</em>, a CBHII, belongs to the family of cellulase B, which is highly resistant to heat. Due to the low level of production of this enzyme in this host, it cannot be used at industrial scale. For expression of cellobihydrolase in yeast, <em>cel6B</em> gene in pSZ143 plasmid was amplified by PCR and then was cloned in to pPICZ&alpha;A vector. Recombinant construct contains <em>cel6B</em> gene transformed to <em>E. coli </em>Jm109 and recombinant were bacteria selected on LB medium with 0.5&micro;g/ml Belleomycin. Recombinant plasmid was linearized and then transformed in Gs115 and KM71H yeast strains by electroporation method. Finally, the best concentration of methanol and the best day of expression of enzyme were determined by DNS method. The results in yeast indicated, the most CBH activity in GS115 and KM71H strains and on PC substrate in 50&deg;C for 16h was 1.98 and 0.475 U (mmol/min)/ml, respectively. Only sample from high yield colony of GS115 strain for CBH expression was confirmed in SDS-PAGE and then the best methanol concentration and day for enzyme expression with same strain was obtained in 4^th days after induction with three percent methanol. In this study, we did not optimize the codons of <em>cel6B</em> gene for expression in <em>P. pastoris</em>. Thus, its decreased expression level and cellobiohydrolase activity may be due to codon usage in Pichia.<br> &nbsp; مخمر, سلوبیوهیدرولاز, فرآوری زیستی تلفیقی, ژن cel6B cellobihydrolase gene, Consolidated Bioprocessing, cel6B, yeast 139 151 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-290-1&slc_lang=fa&sid=1 Fahimeh Heidari-Gharehsoo فهیمه حیدری قره سو fahimehheidarigharehsoo@gmail.com 10031947532846002599 10031947532846002599 No Biotechnology and Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad گروه بیوتکنولوژی و به‌نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد Nasrin Moshtaghi نسرین مشتاقی nasrinmoshtagi@yahoo.com 10031947532846002600 10031947532846002600 Yes Biotechnology and Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Iran گروه بیوتکنولوژی و به‌نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران Baratali Meshkani براتعلی مشکانی mashkaniba@mums.ac.ir 10031947532846002601 10031947532846002601 No 3Medical Biochemistry Department, Faculty of Medical, Mashhad University of Medical Sciences گروه بیوشیمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد Saeed Malekzade-Shafarudi سعید ملکزاده شفارودی malekzadeh-s@um.ac.ir 10031947532846002602 10031947532846002602 No Biotechnology and Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad گروه بیوتکنولوژی و به‌نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد