fa خاموشی ژن bZIP14 با استفاده از CRISPR/Cas9 و بررسی موتانت ها در پاسخ به تنش شبکه آندوپلاسمی در گیاه Marchantia polymorpha مهندسی ژنتیک گیاهی Plant پژوهشي Research <strong><span style="font-family:B Zar;">انباشته شدن پروتئین‌های تانخورده و بد-تاخورده سبب تنش شبکه آندوپلاسمی می‌شود. در پاسخ به تنش شبکه آندوپلاسمی، پاسخ به پروتئین تانخورده </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">(UPR)</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> توسط حس‌گرهای تراغشایی شبکه آندوپلاسمی راه‌اندازی می‌شود. این مسیر مجموعه‌ای از سیگنال‌های پیام‌رسان یکپارچه است که برای بازگرداندن پایداری شبکه‌ آندوپلاسمی طراحی شده است. دو فاکتور رونویسی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> به نام‌های </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP14</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">‌ و </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP7</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> مسیر </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">UPR</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">‌ را در گیاه </span></strong><strong><em><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">Marchantia polymorpha</span></span></em></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> تنظیم می‌کنند. در این مطالعه لاین‌ّهای موتانت </span></strong><strong><em><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bzip14</span></span></em></strong> <strong><span style="font-family:B Zar;">با استفاده از فناوری </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">CRISPR/Cas9</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> در گیاه مارکانتیا جمع‌آوری شده است. بدین منظور توالی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">DNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">‌ ژن </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP14</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> در پایگاه اطلاعاتی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">Marchantia.info</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> به کمک </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">Blastp</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> برای گیاه مارکانتیا شناسایی شد. بدین منظور، توالی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">DNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">ی ژن&nbsp; </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP14</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> با انجام بلاست پروتئینی در وبگاه </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">Marchantia.info</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> شناسایی شد. توالی اگزون به منظور شناسایی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">sgRNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">ها در پایگاه</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">http://crispor.tefor.net/ </span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">&nbsp;وارد و از میان </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">sgRNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">های پیشنهادی، سه کاندید انتخاب شدند. </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">sgRNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">ها درون سازه اختصاصی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">CRISPR/Cas9</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> برای گیاه مارکانتیا به نام </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">pMpGE013</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> وارد و پس از انتقال به اگروباکتری سویه‌ </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">GWB303+pSOUP</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> به گیاه انتقال داده شد. از گیاهان باززا شده در محیط انتخابی دارای هایگرومایسین، استخراج </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">DNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> انجام و پس از تکثیر با پرایمرهای اختصاصی، برای توالی‌یابی ارسال شد. هشت لاین از ۱۱ لاین با توالی صحیح، تغییرات نوکلئوتیدی حذف و اضافه در توالی </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">DNA</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">‌ نشان دادند. یک لاین موتانت انتخاب و برای ارزیابی فنوتیپی و آزمون زنده‌مانی به محیط حاوی ترکیب تونیکامایسین، ماده شیمیایی القا کننده تنش شبکه آندوپلاسمی انتقال یافت. بررسی‌ها نشان داد که </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP14</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;">‌ تنها هومولوگ ژن‌های </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP17</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> و </span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">bZIP28</span></span></strong><strong><span style="font-family:B Zar;"> در گیاه آرابیدوپسیس است. همچنین تحت تنش شبکه آندوپلاسمی، گیاهان موتانت در مقایسه با گیاهان وحشی تفاوت معناداری در سطح ۵ درصد نشان داده‌اند.&nbsp; &nbsp;</span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:red;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"></span></span></span></strong> Accumulation of unfolded and mis-folded proteins cause ER stress.&nbsp;In response to ER stress, the unfolded protein response (UPR) is triggered by ER transmembrane sensor. UPR, a set of integrated signaling pathways, designed to restore ER homeostasis.&nbsp;&nbsp;Two bZIP transcriptional factors regulate the UPR pathway in <em>Marchantia Polymorpha</em>: bZIP14 and bZIP7. In this study, <em>bzip14</em> mutant lines were generated using CRISPR/Cas9. In this order, the bZIP14 DNA sequence was identified by Blastp in&nbsp;Marchantia.info, a database website for <em>M.&nbsp; polymorpha</em>. Exons are implied to find out the proper sgRNAs as candidates in&nbsp;<a href="http://crispor.tefor.net/" target="_blank">http://crispor.tefor.net/</a>. Among all suggested sgRNAs, three of them were selected as candidates. sgRNAs were introduced into pMpGE013, a specific CRISPR/Cas9 vector in <em>M. polymorpha</em>. After transformation to agrobacteria GWB303+pSOUP, it was transformed into the plants. DNA was extracted from plants regenerated in selective media containing hygromycin, amplified using PCR by specific primers, and sent to sequencing. Eight out of 11 lines that were sequenced properly showed deletion and insertion in the DNA sequence. One mutant line was chosen for phenotypic assay and a survival test in the media containing tunicamycin, ER stress inducer. Our result showed that there are two isoforms of bZIP17 and bZIP28 <em>in Arabidopsis thaliana</em>, as homologs with bZIP14 in <em>M. polymorpha</em>. Also, a significant difference (p-value &le; 0.05) was observed between <em>bzip14</em> mutant and wild type under ER stress conditions.&nbsp;&nbsp;<span dir="RTL"></span> پروتئین تانخورده, تنش شبکه آندوپلاسمی, مارکانتیا, bZIP14, CRISPR/Cas9 Unfolded protein response, ER stress, Marchantia polymorpha, bZIP14, CRISPR/Cas9 237 247 http://gebsj.ir/browse.php?a_code=A-10-408-2&slc_lang=fa&sid=1 Azadeh Mohseni آزاده محسنی azadehmohseni34@yahoo.com 10031947532846003688 10031947532846003688 No Department of crop biotechnology and breeding, Ferdowsi University of Mashhad, Iran گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران Mohammad Farsi محمد فارسی farsi@um.ac.ir 10031947532846003689 10031947532846003689 Yes Department of crop biotechnology and breeding, Ferdowsi University of Mashhad, Iran گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشگاه فردوسی مشهد Alireza Seifi علیرضا سیفی arseifi@yahoo.com 10031947532846003690 10031947532846003690 No Department of crop biotechnology and breeding, Ferdowsi University of Mashhad, Iran گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشگاه فردوسی مشهد