دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری & پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان ، solimanielham@yahoo.com
چکیده: (19 مشاهده)
کشف DNA پلی‌مرازهای مقاوم به حرارت از میکروارگانیسم‌های گرمادوست جهش بزرگی در زیست‌شناسی مولکولی و مهندسی ژنتیک ایجاد کرد. آنزیم Tth DNA polymerase (Tth pol)از باکتری Thermusthermophilesنیز از جمله آنزیم‌های پرکاربرد در مهندسی ژنتیک است. خاصیت دوگانه پلیمرازی و رونوشت برداری معکوس، مقاومت در برابر بازدارنده‌های PCRموجود در نمونه‌های زیستی، سرعت بالاتر تکثیر DNA در مقایسه با Taq DNA polymeraseتوجه محققان را برای استفاده از این آنزیم به خود جلب کرده است. در این پژوهش، ژن کدکننده آنزیم Tth pol از باکتری T.thermophilus جدا شد، پس از الحاق به وکتور pTZ57R/Tبه باکتری E.coli DH5α منتقل شد. پس از تأیید انتقال، پلاسمیدهای نوترکیب توالی‌یابی شد و نتایج توالی‌یابی صحت جداسازی ژن Tth pol را تأیید نمود. ژن Tth pol با آغازگرهای اختصاصی تکثیر شده و به وکتور بیانی pET28a الحاق شده و به میزبان بیانی E.coli BL21 منتقل شد. القای بیان با IPTGدر غلظت‌های 8/0 و 1 میلی‌مولار، در دو محیط کشت حداقل تغییریافته و LB، و دمای 25 و 30 درجه سانتی‌گراد انجام شد. نمونه‌برداری تا 10 ساعت پس از القا و در فواصل زمانی 2 ساعته ادامه یافت. الکترفورز نمونه‌ها نشان داد بهترین شرایط بیان Tth polدر دمای 30 درجه، غلظت 1 میلی‌مولار IPTG، محیط کشت حداقل و 10 ساعت پس از القا می‌باشد. به دلیل وجود دنباله هیستیدینی در آنزیم Tth polنوترکیب از رزین نیکل برای خالص‌سازی آن استفاده شد. پس از خالص‌سازی فعالیت پلیمرازی Tth polدر آزمون PCR و فعالیت رونوشت برداری معکوس آن در سنتز cDNAبررسی شد. نتایج نشان داد این آنزیم دارای هر دو ویژگی می‌باشد. با توجه به نتایج به دست آمده، بهینه‌سازی شرایط کشت در مقیاس وسیع‌تر مانند فرمانتور به منظور بیان بیشتر Tth polپیشنهاد می‌شود.
Soleimani E, Katalani C, Shahin-Kaleybar B, Nematzadeh G. Isolation and recombinant Tth DNA polymerase expression in E. coli BL21, purification and enzyme activity investigation. gebsj 2024; 13 (2) : 4 URL: http://gebsj.ir/article-1-512-fa.html
سلیمانی الهام، کتالانی کاملیا، شاهین کلیبر بهزاد، نعمت زاده قربانعلی. جداسازی و بیان نوترکیب آنزیم Tth DNA polymerase در E.coli BL21، خالص‌سازی و بررسی فعالیت آنزیم. مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی. 1403; 13 (2)
